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| ELISA技術原理：以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來. | ||||||||
| 1. 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。 | ||||||||
| 2. 結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性。 | ||||||||
| 3. 酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。 | ||||||||
| 4. 受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。再加入酶標記 的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。 | ||||||||
| 5. 此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。 | ||||||||
| 6. 加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量 與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定 性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水 平），并且重復性好。 | ||||||||
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| 樣本處理及要求： | ||||||||
| 1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。 | ||||||||
| 2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。 | ||||||||
| 3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。 | ||||||||
| 4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。 | ||||||||
| 5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。 | ||||||||
| 6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融. | ||||||||
| 7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 | ||||||||
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| 操作步驟 | ||||||||
| 1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在*、第二孔中分別加標準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為30ng/L，20ng/L ，10ng/L，5ng/L， 2.5ng/L）。 | ||||||||
| 2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 | ||||||||
| 3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。 | ||||||||
| 4. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。 | ||||||||
| 5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。 | ||||||||
| 6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。 | ||||||||
| 7. 溫育：操作同3。 | ||||||||
| 8. 洗滌：操作同5。 | ||||||||
| 9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. | ||||||||
| 10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。 | ||||||||
| 11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。 | ||||||||
| 注意事項： | ||||||||
| 1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。 | ||||||||
| 2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。 | ||||||||
| 3． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。 | ||||||||
| 4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。 | ||||||||
| 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 | ||||||||
| 6． 底物請避光保存。 | ||||||||
| 7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準. | ||||||||
| 8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。 | ||||||||
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
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