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神經肽放免檢測服務操作使用說明

更新時間:2014-09-25      瀏覽次數:2257

上海信帆生物代理銷售神經肽放免檢測服務,現貨供應,歡迎。

 

一.試劑盒的組成

1.            抗體          瓶,(每瓶加緩沖液          ml復溶)。

2125I        標記物        瓶,(每瓶加緩沖液          ml復溶)。

3           標準品25.6ng,使用時用緩沖液稀釋成每100ul分別含2.5、   

  5、10、20、40、80、160、320、640、1280pg的標準品。方法:標準品瓶內加入2ml緩沖液充分混勻,即為每100ul含1280pg的標準品,然后吸取500ul標準液再用500ul緩沖液稀釋即為640pg濃度, 依次倍比稀釋至每100ul含 2.5pg。加樣時5、20pg兩點可以不做。注意每一個濃度務必充分混勻。

4.分離劑:50ml/瓶。(用前充分混勻)

5緩沖液:50ml/瓶。

6說明書1份。

   收到試劑盒后應2-8℃保存。在2周內進行標本測定,使用中應避免反     

   復凍融。試劑盒NSB應在10%以內,B0值在30~40%之間。

 

二.操作步驟

1. 平衡飽和加樣程序

   多用于組織提取液中神經肽含量的測定。以大鼠垂體、下丘腦β-EP免疫活性物質含量測定為例。

         大鼠垂體、下丘腦β-EP含量的RIA 測定程序(總反應體積300ul)

 

 

標 準 曲 線*

樣 本**

 

T

NSB

B0

2.5

10

40

80

160

320

640

1280

垂體

下丘腦

管     號

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

β-EP標準品

/

/

/

100

100

100

100

100

100

100

100

/

/

樣    品

/

/

/

/

/

/

/

/

/

/

/

1

100

β-EP抗血清

/

/

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

緩 沖 液

/

200

100

/

/

/

/

/

/

/

/

99

/

125I-β-EP

                     每管各加100μl、混勻

孵   育

                        4℃孵育  24h

分   離

  加分離劑500ul/管,混勻、室溫放置45分鐘。4000r/20min離心,即刻棄上清。

計   數

     測定沉淀的cpm 值(B)。

*標準曲線宜做2-3條,既同一濃度應有2-3個管。

**腦組織及其它們提取液(樣品)的加樣量,應根據各組織內神經肽的含                           

  量來確定加樣量??偧訕恿坎蛔?00ul者用緩沖液補足。

 

 

2.  順序飽和加樣程序

    用于神經肽含量較低的樣本,如血漿、腦脊液、推挽灌流液中神經肽的含量測定。以人血漿AVP免疫活性物質含量測定為例。

 

           人血漿AVP含量RIA測定程序(總體積500ul)

 

 

標   準   曲   線

樣本

 

T

NSB

B0

NSB

2.5

10

40

80

160

320

640

1280

血漿

管  號

1

2

3

4

6

7

8

9

10

11

12

13

14

AVP標準品

/

/

/

/

100

100

100

100

100

100

100

100

/

樣  品

/

/

/

/

/

/

/

/

/

/

/

/

300

無肽血漿

/

/

/

400

/

/

/

/

/

/

/

/

/

AVP抗血清

/

/

100

/

100

100

100

100

100

100

100

100

100

緩沖液

/

400

300

/

200

200

200

200

200

200

200

200

/

孵  育

                            4℃ 孵 育  24h

125I-AVP

                         每  管 各 加100ul、混勻

孵  育

                            4℃ 孵  育  24h

分離劑

       加分離劑500ul/管,混勻、室溫放置45分鐘。4000r/20min離心,即刻棄上清。

計   數

         測定沉淀的cpm 值(B)。

   附:無肽血漿的制備(用于血漿的直接測定):

取4%加膜活性炭2ml離心,棄上清,加等體積血漿,充分振蕩10min,再離心(4000rpm,10min),取上清。上清液重復離心1-2次,即為無肽血漿。血漿中的生物活性物質被活性炭吸附而去除。血漿樣本加樣量,要在預實驗中摸索,每次測定要有正常樣品對照。神經肽的RIA,影響因素較多,要特別注意細心操作。

 

三.標準曲線的繪制和樣本含量的計算

    本法分離沉淀計數為結合(B)的cpm數。計算標準管與zui大結合(B0)的比值(B/ B0)×100%,以不同濃度的對數值為橫坐標,B/ B0的百分比為縱坐標,在半對數紙上繪制標準曲線,從標準曲線上找出所測樣本抗原(神經肽)的含量(上述計算通常可以由計算機處理),再換算成每ml血漿或每mg組織濕重或每mg蛋白某種神經肽的含量。

如果計數器的本底較高,一定要從計算中扣出本底,一般NSB要小于10%。

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