膠原蛋白的種類及其在組織中的分布根據(jù)其結(jié)構(gòu)，可以分為纖維膠原、基膜膠原、微纖維膠原、錨定膠原、六邊網(wǎng)狀膠原、非纖維膠原、跨膜膠原等。根據(jù)它們?cè)隗w內(nèi)的分布和功能特點(diǎn)，可以將膠原分成間質(zhì)膠原、基底膜膠原和細(xì)胞外周膠原。間質(zhì)型膠原蛋白分子占整個(gè)機(jī)體膠原的絕大部分，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白分子。
 

　　I型膠原的序列結(jié)構(gòu) I型膠原分子含有3條α 多肽鏈每條鏈含有1000多個(gè)氨基酸不同的脊椎動(dòng)物I型膠原α 鏈的氨基酸序列結(jié)構(gòu)只有微小的差別。 α 多肽鏈中每3個(gè)氨基酸序 膠原類型 組織分布 I 型 皮膚、骨、角膜、肌腱、腫瘤 Ⅱ型 軟骨、玻璃體 Ⅲ型 皮膚、子宮壁、血管壁 Ⅳ型 基底膜、胎盤(pán) V 型 皮膚、胎盤(pán)、羊膜 Ⅵ型 子宮壁、皮膚、角膜 Ⅶ 型 羊膜、皮膚 Ⅶ 型 內(nèi)皮細(xì)胞 Ⅸ型 軟骨 x 型 軟骨 Ⅺ 型 軟骨、脊椎盤(pán) Ⅻ 型 皮膚、腱 xⅢ型 內(nèi)皮細(xì)胞 列組成中就有一個(gè)重復(fù)的甘氨酸因?yàn)楦拾彼嵊衵ui小的側(cè)鏈基團(tuán)這樣的序列結(jié)構(gòu)使α 鏈間的距離縮短、 空間zui小鏈與鏈間緊靠在一起形成的螺旋結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。大約有35%的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元Gly-X-Y中的X和Y殘基分別為脯氨酸和羥脯氨酸。 羥脯氨酸是由脯氨酸被脯氨酰羥化酶羥基化作用后演變而來(lái)的其羥基對(duì)于氫鍵的形成以及三股螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定都是必需的。 羥脯氨酸在膠原的氨基酸組成中含有大約10%的量其含量可用于定量測(cè)定膠原。此外I型膠原的螺旋和非螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)還含有賴氨酸和羥賴氨酸與羥脯氨酸的形成類似羥賴氨酸是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)通過(guò)賴氨酰羥化酶的作用由賴氨酸的羥基化作用而形成的。賴氨酸和羥賴氨酸殘基的共價(jià)交聯(lián)有利于膠原分子三股螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定同時(shí)羥賴氨酸的形成有利于糖組分的吸收，可以發(fā)生半乳糖化或葡萄糖半乳糖化通過(guò)羥賴氨酸殘基位點(diǎn)發(fā)生O-糖基化。
 

　　1.2 結(jié)構(gòu)
 

　　膠原與大多數(shù)合成聚合物相比具有*的生理和生物特性這主要來(lái)源于膠原分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性。I型膠原每一條α 鏈形成左手螺旋每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)大小約0.87nm3條α 鏈又相互纏繞形成右手螺旋結(jié)構(gòu)每個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)大小約8.6nm三股螺旋形成的膠原分子平均分子量約300kDα長(zhǎng)度300nm直徑1.5nm。三股螺旋分子間以一定間距、呈縱向?qū)ΨQ交錯(cuò)排列形成原纖維。 分子間交錯(cuò)距離為67nm縱向相鄰分子間距為40nm。膠原原纖維再聚集形成纖維然后再形成更大的纖維束。 三股螺旋分子的有序聚集使膠原纖維具有一定的強(qiáng)度和韌性。 (α)氨基酸序列結(jié)構(gòu) 1 條 α 鏈的左手螺旋結(jié)構(gòu)和 3 條 α 鏈形成的右手三股螺旋結(jié)構(gòu) (c)原纖維的聚集結(jié)。
 

　　2.1 生物醫(yī)學(xué)材料與臨床應(yīng)用
 

　　由膠原制成的手術(shù)縫合線既有與天然絲一樣的高強(qiáng)度又有可吸收性在使用時(shí)既有優(yōu)良的血小板凝聚性能止血效果好又有較好的平滑性和彈性縫合結(jié)頭不易松散操作過(guò)程中不易損傷機(jī)體組織。膠原于不同的細(xì)胞之間存在很強(qiáng)的親和力與在傷口的愈合過(guò)程中起到關(guān)鍵作用的生長(zhǎng)因子間也有著特殊的親和力在血液凝固后還可以通過(guò)刺激組織的再生與修復(fù)來(lái)防止再次發(fā)生出血所以膠原可以作為凝血材料。 同時(shí)用合成材料或膠原蛋白在血漿代用品、 人造皮膚、人工血管、 骨的修復(fù)和人工骨和固定化酶的載體等方面的研究和應(yīng)用方面都十分的廣泛。
 

　　2.2 美容與保健
 

　　膠原蛋白由動(dòng)物皮提取皮中除膠原蛋白外還含有透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等蛋白多糖它們含有大量極性基團(tuán)是保濕因子且有阻止皮膚中的酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素的作用故膠原蛋白有保濕、美白、防皺、祛斑等作用可廣泛應(yīng)用于美容、美膚、美發(fā)用品中。膠原蛋白的美容功能主要是保濕作用、修復(fù)皮膚、美白作用、潤(rùn)澤頭發(fā)它的保健功能主要體現(xiàn)在減肥、降壓、降血脂、補(bǔ)鈣和排出體內(nèi)的鋁。
 

　　2.3 在食品中應(yīng)用
 

　　膠原蛋白在食品中有兩方面的應(yīng)用一是功能二是營(yíng)養(yǎng)。人們食用含膠原蛋白豐富的食品能有效地增加皮膚組織細(xì)胞的儲(chǔ)水能力增強(qiáng)和維持肌膚良好的彈性延緩肌體的衰老同時(shí)還可強(qiáng)筋健骨增強(qiáng)體質(zhì)。利用膠原蛋白的成膜性可將其用作固化酶的膜材料和肉食品標(biāo)簽現(xiàn)已經(jīng)在歐洲實(shí)際應(yīng)用膠原蛋白可作為食品粘合劑合成纖維膜用作肉類、魚(yú)類等的包裝紙。此外膠原蛋白還可作為食品保護(hù)層具有抗氧化性可保持肉食品的顏色鮮亮。
 

　　2.4 在其他工業(yè)的應(yīng)用
 

　　制革工藝過(guò)程中剩下的廢棄物中含有豐富的膠原蛋白可以提取出來(lái)用作飼料的動(dòng)物蛋白資源實(shí)現(xiàn)資源利用同時(shí)近年來(lái)膠原蛋白在造紙工業(yè)、 制革工業(yè)、Et用化工業(yè)等輕工業(yè)中也有越來(lái)越多的應(yīng)用。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步對(duì)于膠原蛋白的研究也將繼續(xù)的深入膠原蛋白也將應(yīng)用的更加廣泛。
 

　　3 利用轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器生物試劑膠原蛋白
 

　　3.1 轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器
 

　　轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器通常利用以下生物體為材料細(xì)菌(主要是大腸桿菌)、酵母(畢赤酵母、釀酒酵母)、單細(xì)胞藻類、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因反應(yīng)器(奶牛、奶山羊、兔、豚鼠、大鼠或小鼠)以及動(dòng)物膀胱上皮細(xì)胞反應(yīng)器。 由于細(xì)菌繁殖快且培養(yǎng)條件要求低因此是轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器的材料。目前有不少藥用蛋白在大腸桿菌中成功地進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因表達(dá)并且實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生物試劑如人胰島素、干擾素及蛋白酶抑制劑等。然而大腸桿菌有個(gè)致命的缺陷即大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)無(wú)法進(jìn)行蛋白翻譯后修飾，對(duì)于一些具有構(gòu)象的人的藥用蛋白利用大腸桿菌表達(dá)后無(wú)法糖基化。同時(shí)由于大腸桿菌是原核生物沒(méi)有ER因此也沒(méi)有能幫助蛋白質(zhì)折疊成構(gòu)象的分子伴侶蛋白及一些修飾合成蛋白如羥基化、形成二硫鍵的酶。另外大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)物在分離時(shí)如稍有疏忽就會(huì)含有一些熱原甚至還可能混有大腸桿菌自身的內(nèi)毒素這些都是潛在的隱患。膠原蛋白這種復(fù)雜的蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)顯然是無(wú)法形成結(jié)構(gòu)的。 酵母作為一種真核生物自然具備分子伴侶蛋白以及一些糖基化、羥基化、 乙酰基化的酶對(duì)于一些具有結(jié)構(gòu)的蛋白及需要在合成后修飾的蛋白是比較理想的而且酵母細(xì)胞的培養(yǎng)條件也較哺乳動(dòng)物細(xì)胞低得多非常適宜于大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵生物試劑。目前國(guó)內(nèi)生物試劑的乙肝疫苗都是利用酵母生物試劑的。然而酵母系統(tǒng)對(duì)于翻譯后加工的蛋白并非*等同于哺乳動(dòng)物因而由酵母系統(tǒng)所生物試劑的重組蛋白可能會(huì)有一些不符合要求的特性如免疫原性、活性低等。活性低可能是由于重組蛋白側(cè)鏈殘基上的糖基化程度太高所致。 至于以昆蟲(chóng)細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生物試劑轉(zhuǎn)基因重組蛋白目前還處于實(shí)驗(yàn)室水平雖然有些表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)量很可觀。這一系統(tǒng)的糖基化形式很特別相比較 而言桿狀病毒系統(tǒng)更加適合實(shí)驗(yàn)室水平的生物試劑。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是生物試劑一些哺乳動(dòng)物藥用蛋白的的系統(tǒng)但它的培養(yǎng)條件將其局限在實(shí)驗(yàn)室的水平上。在生物試劑成本、所需設(shè)備與時(shí)間、生物試劑管理、產(chǎn)物的純化提取等方面轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的反應(yīng)器都具有無(wú)比的*性。有數(shù)據(jù)表明建立一個(gè)10000L規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器要用時(shí)3-5年花費(fèi)2.5億-5.0億美元而以一個(gè)大型哺乳動(dòng)物的作為反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因 “生物農(nóng)場(chǎng)” zui多花費(fèi)不超過(guò)8000萬(wàn)美元甚至更少。
 

　　鑒于上述優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器已經(jīng)是當(dāng)前開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)目前由表達(dá)轉(zhuǎn)基因重組蛋白的量有的可以達(dá)到每升幾克的水平。首先是轉(zhuǎn)基因的牛或者羊從出生到性成熟能泌乳需要較長(zhǎng)的時(shí)間其次還有泌乳周期的間斷問(wèn)題對(duì)于較小的動(dòng)物如兔、大鼠雖然周期短但是泌乳量又受到限制而像胰島素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等藥物蛋白對(duì)動(dòng)物體自身也有毒副作用當(dāng)其在中高水平表達(dá)時(shí)可能通過(guò)組織周?chē)奈⒀鼙恢匦挛諏?duì)動(dòng)物體本身嚴(yán)重不利嚴(yán)重的還會(huì)造成動(dòng)物死亡，這就限制了這些蛋白只能以前體或者非活性的形式在中表達(dá)。雖然轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器還存在一些問(wèn)題且目前的技術(shù)手段還無(wú)法克服但是綜合生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)用其生物試劑功能蛋白的前景還是美好的畢竟還沒(méi)有一種生物反應(yīng)器更具有*性與吸引力。
 

　　3.2 利用轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器生物試劑膠原蛋白
 

　　膠原蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白與其他一些功能蛋白相比膠原蛋白對(duì)于宿主本身是很溫和的至少不會(huì)因?yàn)楸凰拗鞅旧砦斩鴮?duì)宿主產(chǎn)生毒副作用。早在1987年Schnieke等就將人I型原膠原蛋白[Proα1(I)]基因?qū)氲絇roα1(I)缺陷的鼠Mov-13細(xì)胞系中[此細(xì)胞系正常表達(dá)Proα2(I)]獲得了具有正常功能的人鼠雜合的I型膠原蛋白。 Toman等則在釀酒酵母中同時(shí)表達(dá)了4種基因即Proα(I)、 Proα2 (I)和P4H酶的2種亞基的基因獲得了穩(wěn)定表達(dá)的重組人I型原膠原蛋白異源三聚體。1999年有報(bào)道將完整膠原蛋白的Proα1(I)與Proα2(I)基因轉(zhuǎn)入小鼠并在小鼠中表達(dá)。Toman等也獲得了轉(zhuǎn)Proα1(I)原膠原基因的小鼠中表達(dá)的原膠原量已達(dá)到8 mgmL且所獲得的原膠原蛋白能夠形成同源三聚體的 結(jié)構(gòu)但不足的是Pro與Lys殘基羥基化程度不夠。同源三聚體的I型膠原蛋白與成纖維原的I型膠原蛋白異源三聚體有相似的Tm 值且長(zhǎng)度相似在正常的組織中有I型原膠原蛋白同源三聚體存在的現(xiàn)象。 John等在小鼠中表達(dá)了Proa2(I)與P4H的d與B亞基的基因在中獲得的原膠原的產(chǎn)量達(dá)到50-200txgmL原膠原上的脯氨酸殘基羥基化程度與生物體正常的原膠原一致并能形成同源三聚體結(jié)構(gòu)還有熱穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)域。但是Toman和John等在小鼠中獲得的都是成熟膠原的前體形式---原膠原。以這樣的形式在中表達(dá)分泌蛋白是優(yōu)是劣還不能一概而論，就是對(duì)于膠原這樣的結(jié)構(gòu)蛋白而言也很難加以評(píng)判。因?yàn)槌墒斓哪z原蛋白的溶解度要比原膠原低幾個(gè)數(shù)量級(jí)所以在中分泌不會(huì)對(duì)宿主本身造成麻煩，但問(wèn)題是以前體的形式分泌要想成品化還要通過(guò)N端、C端蛋白酶的消化以去掉前肽。
 

　　迄今，I型膠原蛋白的轉(zhuǎn)基因生物試劑還處在實(shí)驗(yàn)室的規(guī)模還沒(méi)有在大的家畜(奶牛或者奶山羊)中表達(dá)的報(bào)道。然而面對(duì)日益增長(zhǎng)的對(duì)膠原蛋白的需求在牛或者羊的中生物試劑I型膠原蛋白勢(shì)在必行目前作者所在實(shí)驗(yàn)室正著手這方面的研究。雖然生物反應(yīng)器生物試劑蛋白還有很多問(wèn)題需解決但是隨著技術(shù)水平的進(jìn)步新技術(shù)平臺(tái)的不斷出現(xiàn)這些問(wèn)題也會(huì)迎刃而解。由于生物反應(yīng)器生物試劑的重組人的藥用和食甩蛋白是在zui接近人體自然狀態(tài)下合成的，所以有著很大的潛力和商業(yè)價(jià)值。在不久的將來(lái)有很大一部分的人源性的藥用或食用蛋白會(huì)在生物反應(yīng)器中得到生物試劑。