為了提高ELISA的檢測(cè)速度，使之更方便地應(yīng)用于科研及現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查工作，根據(jù)ELISA的實(shí)驗(yàn)原理，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種ELISA試劑盒，并應(yīng)用于血吸蟲病人血清抗體的檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

　　1　材料與方法　①日本血吸蟲成蟲抗原的制備　以1500條日本血吸蟲尾蚴經(jīng)皮膚感染家兔，45天后經(jīng)門靜脈灌注收集成蟲，用生理鹽水洗滌后用玻璃勻漿器勻漿，以12000×g離心，收集上清液，測(cè)定其蛋白含量。②酶聯(lián)SPA結(jié)合物　購(gòu)自上海生物制品研究所，臨用前用1ml PBS溶解。③血清　50份日本血吸蟲病人血清來(lái)自江西省血吸蟲病流行區(qū)，臨用前分別用1∶2，1∶10；1∶20；1∶40的HRP-SPA液將血清稀釋到1∶50的濃度。④ELISA快速法的建立　用pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋日本血吸蟲成蟲抗原至80μg/ml，每孔50μl包被酶標(biāo)板，4℃放置過(guò)夜，第二天用PBS洗滌三次后用含1%BSA的PBS液于37℃封閉45min，用PBST(含0.05%Tween-20)洗板三次；在酶標(biāo)板孔中分別加入用不同稀釋度的酶聯(lián)SPA稀釋到1∶50的病人血清50μl，37℃反應(yīng)60min，再用PBST洗板三次，加入底物鄰苯二胺應(yīng)用液50μl，37℃顯色10min，加入2mol/L的硫酸溶液中止反應(yīng)，觀察結(jié)果，尋找zui適的酶聯(lián)SPA液的工作濃度。⑤檢測(cè)血吸蟲病人血清抗體　方法同④，酶聯(lián)SPA的工作濃度為1∶40，病人血清的稀釋度為1∶50。⑥常規(guī)ELISA檢測(cè)血吸蟲病人血清抗體　按常規(guī)方法［1］，以每孔50μl日本血吸蟲成蟲抗原包被酶標(biāo)板，4℃放置過(guò)夜，第二天用PBST洗板三次后用含1%BSA的PBS 37℃封閉1小時(shí)，用PBST洗板后加入1∶50稀釋的病人血清，37℃反應(yīng)60min，用PBST洗板三次，再加入1∶40稀釋的酶聯(lián)SPA，37℃反應(yīng)60min，洗板后加入底物鄰苯二胺應(yīng)用液，37℃顯色10min，用2mol/L的硫酸終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

　　2　結(jié)果與討論　常規(guī)的ELISA檢測(cè)血清抗體的方法是將已知的抗原包被在酶標(biāo)板上，與血清中待測(cè)抗體結(jié)合后通過(guò)加入酶聯(lián)抗人IgG(HRP-IgG)或酶聯(lián)SPA(HRP-SPA)顯色的兩個(gè)過(guò)程來(lái)完成的。HRP-SPA與血清中待測(cè)抗體結(jié)合的位點(diǎn)是Ig的Fc段，從理論上講HRP-SPA與Ig的Fc段結(jié)合不會(huì)影響Ig的Fab段與抗原的結(jié)合，或者影響很小，因此可以設(shè)想將抗原與待測(cè)抗體反應(yīng)的過(guò)程，待測(cè)抗體與酶標(biāo)二抗反應(yīng)過(guò)程在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行，從而使整個(gè)反應(yīng)過(guò)程減少一步，Sundaram等［2］根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)了偶聯(lián)探針Western blot方法，取得了好的實(shí)驗(yàn)效果，我們依據(jù)相同的原理，設(shè)計(jì)了ELISA快速法，用于檢測(cè)血吸蟲病人血清抗體。用該法及常規(guī)ELISA同時(shí)檢測(cè)50份江西省血吸蟲病流行區(qū)病人血清標(biāo)本，49份結(jié)果陽(yáng)性，1份標(biāo)本為陰性，陰性標(biāo)本均為第7份標(biāo)本，兩種方法的檢 測(cè)結(jié)果*一致。

　　抗原與待測(cè)抗體反應(yīng)的過(guò)程，待測(cè)抗體與酶標(biāo)二抗反應(yīng)過(guò)程在同一反應(yīng)體系中同時(shí)進(jìn)行，因病人血清中存在的非目標(biāo)檢測(cè)抗體會(huì)消耗一部分HRP-SPA，為達(dá)到常規(guī)ELISA檢測(cè)的敏感度，則可能需要增加HRP-SPA的用量，通過(guò)測(cè)定HRP-SPA的工作濃度與可檢測(cè)出血清抗體滴度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)分別按1∶2，1∶10，1∶20，1∶40稀釋的HRP-SPA，能測(cè)出混合陽(yáng)性血清zui高滴度均為1∶12800，與常規(guī)的ELISA的檢出滴度相同，因此ELISA快速法并不需要增加HRP-SPA的用量，常規(guī)使用時(shí)只要按廠家推薦的1∶40的工作濃度使用即可獲得滿意的使用效果。

　　ELISA快速法的抗體檢測(cè)效果與常規(guī)ELISA相同，檢測(cè)條件亦一致，檢測(cè)時(shí)間則可明顯縮短，可顯著提高工作效率，對(duì)提高抗血吸蟲抗體以及其它血清抗體檢測(cè)方法的檢測(cè)速度方面將會(huì)有一定的實(shí)用價(jià)值。