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信帆生物:免疫組化代測,免疫組化操作

更新時間:2015-12-22      瀏覽次數(shù):1571

免疫組化代測,免疫組化試劑盒,免疫組化操作步驟

  一 免疫組化(LP 法)操作步驟

  1. 切片常規(guī)脫蠟至水。如需抗原修復(fù),可在此步后進(jìn)行

  ⒉ 緩沖液洗 3min/2 次。

  ⒊ 為了降低內(nèi)源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色,將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

  ⒋ 緩沖液洗 5min/2 次。

  ⒌ 滴加 Ultra V Block , 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

  (注:孵育不要超過 10 分鐘,否則會導(dǎo)致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 - 10% 正常羊血清,這一步可以省略。)

  ⒍ 緩沖液洗 5min/2 次。

  ⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小時。(具體孵育時間和溫度由試驗者zui終決定)

  ⒏ 緩沖液洗 5min/2 次。

  9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增強(qiáng)子),在室溫下孵育 20 分鐘。

  10 .緩沖液洗 5min/2 次。

  11 .滴加 HRP Polymer(酶標(biāo)二抗) ,在室溫下孵育 30 分鐘。

  (注:HRP Polymer 對光敏感,應(yīng)避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。)

  12 .緩沖液洗 5min/2 次。

  13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen),混勻后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分鐘。(具體時間由染色深淺決定。)

  14 .自來水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明,封片。

二.免疫組化主要步驟
1. 洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中,將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys帶正電,而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷,從而產(chǎn)生吸附作用。
2. 包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟,先稍微冷卻,然后再將待包埋的組織置于石蠟之中,并排列整齊,再將塑料模具盒蓋上,zui后加入少許液體石蠟,進(jìn)行冷凍,使石蠟變成固態(tài)。
3.切片:將包埋好的組織從模具上取下來,并置于石蠟切片機(jī)上,切片機(jī)通過調(diào)節(jié)上下左右來來使組織和切割方向一致,然后調(diào)節(jié)切片的厚度,一般為5µm,如果比較難切,則可以適當(dāng)調(diào)整厚度,用毛筆將切割的載玻片向外拉,并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4. 撈組織:當(dāng)組織載玻片置于40°C溫水中之前,要先將水浴中的氣泡趕走,以免氣泡受熱上浮而貼到組織上,組織受熱展開,是組織不起皺紋,用載玻片撈組織時,一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張,其中2-3張是備用的,每張載玻片上通常撈兩份組織,做對照使用,這樣形成的誤差就比較小了,而且撈載玻片的時候方向一致,以便觀察,再將撈出來的載玻片置于架子上,放入37°C溫箱中烘干。
5. 脫蠟:依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當(dāng)延長脫蠟時間,一般為12-15min.
6.抗原修復(fù):脫蠟后在清水中沖洗一段時間,加入3%H2O2浸泡10min,從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來。
7.血清封閉:冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,馬上加上血清,使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來,然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍(900µlPBS:100µl血清封閉液)。
8. 加一抗:將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,加一抗,如果做對照實(shí)驗,就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。
9. 加二抗:將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。
10. 加SABC:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍(990µlPBS:10µlSABC)。
11. 加顯色劑:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻)   A:DAB        B:H2O2        C:磷酸緩沖液
12. 復(fù)染:將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后,浸泡于蘇木精中染色,一般動物組織為半分鐘,植物組織3-5min。
13. 脫水:將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min,zui后浸泡在二甲苯中,搬到通風(fēng)柜中。
14. 封片:用中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側(cè),然后輕輕放下另一側(cè),以免產(chǎn)生氣泡,封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。
 

三. 免疫組化染色步驟

  冰凍切片 4-8um ,室溫放置 30 分鐘后,入 4 ℃丙酮固定 10分鐘,PBS洗,5分鐘x3,用過氧化氫孵育5-10分鐘,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

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