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上海信帆告訴你酵母RNA的分離和鑒定

更新時間:2015-11-11      瀏覽次數:1955

實驗原理

  由于RNA的來源和種類很多,因此提取方法各異,一般有苯酚法、去污劑法、和鹽酸胍法。其中苯酚法是實驗室zui常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后,RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中。DNA和蛋白質則留在酚層中。向水層加入乙醇后,RNA即以白色絮狀沉淀析出,此法能較好地除去DNA及蛋白質,提取的RNA具有生物活性。

  工業上制備RNA多選用成本低,適于大規模操作的稀堿法及濃鹽酸。用發酵工業的下腳料如酵母、白地酶如青霉菌菌絲體登提取RNA,其得率常為菌種重量的3%~5%。而DNA含量僅為0.03%~0.52%,因此提取RNA多以酵母為原料。稀堿法是用氫氧化鈉溶液,使細菌細胞壁變性,濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理,同時加熱,以改變細胞壁的通透性,使核酸從細胞內釋放出來。用稀堿法使酵母細胞裂解后,用酸中和,然后除去菌體,使乙醇沉淀上清液中的RNA或將pH值調至RNA的等電點,是蛋白質沉淀出來。

  RNA是生物高分子化合物,進一步水解可生成磷酸、戊糖和堿基。各種組分可用于下述方法鑒定:

  1.磷酸于鉬酸銨試劑作用能產生黃色的磷鉬酸銨沉淀。

  2.核糖與地衣酚試劑反應呈鮮綠色。

  3.嘌呤堿與硝酸銀產生白色的嘌呤銀化合物沉淀。

實驗方法

  1.酵母RNA提取:

  (1)稱4g干酵母粉置于100ml燒杯中,加入40ml0.2%氫氧化鈉溶液,沸水浴上加熱30分鐘,不斷攪拌。

  (2)加入數滴乙酸溶液使提取液呈酸性,4000r/min,離心10~15分鐘。

  (3)取上清液,加入30ml 95%乙醇洗2次,每次用10ml。

  (4)用無水乙醇洗兩次,每次10ml,洗滌時可用小玻棒小心攪動沉淀。

  (5)用布氏漏斗抽濾,沉淀在空氣中干燥。

  (6)稱量所得RNA樣品重量,計算得率。

  2.RNA組分鑒定:

  (1)水解RNA:像錐形瓶中加入少量(0.1~0.2g)酵母RNA個10%硫酸溶液15ml,在瓶口上插一玻璃小漏斗,漏斗上蓋上表面皿,然后在沸水浴中加熱水解約30分鐘,過濾,取濾液進行下列實驗。

  (2)嘌呤堿基的檢查:取試管一支,加入1ml 0.1mol/L硝酸銀溶液,再逐滴加1mol/L氨水至沉淀消失。然后加入1ml濾液,放置片刻,觀察有無嘌呤堿基的銀化合物沉淀產生。

  (3)磷酸的檢查:取2ml濾液放入1支試管中,加入5滴硝酸銀和1ml鉬酸銨溶液后,在沸水中加熱,觀察有無黃色磷鉬酸銨沉淀產生。

  (4)戊糖的檢查:取一支試管,加入1ml濾液,然后加入2ml地衣酚試劑,搖勻后在沸水浴上加熱10~15分鐘,觀察顏色的變化。  

注意事項

  1.稀堿法提取的RNA為變性RNA,可用于RNA組分鑒定及單核苷酸制備,不能作為RNA生物活性實驗材料。

  2.脫氧核糖及核糖均可與地衣酚反應。因此地衣酚試驗不能作為RNA與DNA鑒定的依據。

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