細胞膜蛋白提取試劑盒實驗操作！
產(chǎn)品名稱：細胞膜蛋白提取試劑盒
規(guī)格：50T
儲存：2~8℃保存
細胞膜蛋白提取試劑盒能夠從哺乳動物新鮮或凍存的組織塊、貼壁或懸浮細胞中制備細胞膜與胞內(nèi)質(zhì)膜組分。其*的試劑成分與優(yōu)化的制備方案使胞膜制備過程簡單易行，無需特殊設備和超速離心，可在1小時內(nèi)完成。應用本試劑盒制備的胞膜是細胞膜和細胞器膜如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及質(zhì)膜的混合物。制備得到的產(chǎn)物純度可勝任后續(xù)的免疫沉淀、蛋白印跡、2-D gel、酶活性檢測和受體分析等實驗。
實驗步驟：
收集細胞：(在每一次制備過程中，使用等量的細胞數(shù)將明顯提高后續(xù)檢測結果的一致性，因此建議在制備前對細胞準確計數(shù))
貼壁細胞：用PBS緩沖液沖洗細胞平皿，用胰蛋白酶消化細胞。800g離心5-10分鐘，棄上清，用PBS緩沖液重懸洗滌細胞并再次離心收集細胞。
懸浮細胞：800g離心5-10分鐘，棄上清。用PBS緩沖液重懸洗滌細胞并再次離心收集細胞。
以下制備過程要在4 oC或冰水浴中進行
組織細胞勻漿裂解
向每1x107個細胞或每100µl(細胞離心后的體積)細胞沉淀中加入500µlCER試劑，震蕩重懸，冰浴2分鐘。將細胞懸液轉移到冰預冷的玻璃勻漿器內(nèi)，在冰水浴中上下手動勻漿20-30次。
注意：此破碎細胞步驟為關鍵環(huán)節(jié)。要使用1-3ml小容積玻璃勻漿器，須選用間隙嚴密的研杵，其特征是將研杵插入勻漿器套管后，可提起研杵而套管不會脫落。有效研磨是上下推拉而不是旋轉。破碎效果與細胞類型有關，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細胞應小于5%。
組織塊勻漿裂解：
取250mg哺乳動物新鮮或-80 oC凍存組織塊放入冰預冷的玻璃勻漿器內(nèi)，加入500µlCER試劑。用研杵搗碎組織塊，上下手動勻漿20次，冰浴10分鐘，然后上下手動勻漿7次。
注意：與培養(yǎng)細胞特別是貼壁細胞相比，組織塊中的細胞在勻漿時較易破碎，因而并非必須選擇間隙嚴密的研杵。如果研杵與套管過于嚴密，會使組織勻漿困難，可選用研杵與套管稍松的勻漿器，破碎效果與組織細胞類型有關，可在相差顯微鏡下檢查，未裂解細胞應少于5%。
粗提物制備：
取約500µl裂解物，轉移到新的離心管中，800g ,4oC離心5分鐘。上清為胞膜-胞漿混合物。
胞膜胞漿制備：
1)將步驟三獲得的上清轉移到新的離心管中，估計上清的體積；
2)加入上清液1/10體積的MER與上清液混合，冰浴5分鐘；
3)14,000rpm，4oC離心30分鐘；
4)沉淀為胞膜組分，含有細胞膜和亞細胞器碎片，可短暫離心除盡液體，用50-100µl Suspension Buffer重懸備用或用RIPA裂解胞膜；
更新時間：2021-09-06 
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