血清內(nèi)毒素(LPS)檢測(cè)試劑試劑盒試劑原理

【用途】顯色基質(zhì)鱟試劑 ( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于體外細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢測(cè)，禁止以任何途徑進(jìn)入機(jī)體。

【原理】鱟試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品,鱟試劑中 含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下（溫 度，pH 值及無干擾物質(zhì)），細(xì)菌內(nèi)毒素激活 C  因子，引起一系列酶促反應(yīng)， 激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)，使其分解為 多肽和黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm） 。在一定時(shí)間內(nèi)，pNA 的 生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)，據(jù)此，可以定量供試品的內(nèi)毒素濃度。 同時(shí)，對(duì)硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色（λmax = 545nm）， 避免了供試品本身的顏色對(duì) 405nm 處吸收峰的干擾。

1 .材料和設(shè)備

1.1  試劑

鱟試劑、細(xì)菌內(nèi)毒素工作品、顯色基質(zhì)、偶氮化試劑 1  、偶氮化試劑 2  、偶氮化試 劑 3、HC l (  反應(yīng)終止劑)  、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

1.2 器材

無熱原試管、無熱原吸頭。

旋渦混合儀、移液器、多道移液器、封口膜、試管架。 恒溫水浴箱（37±1℃）、分光光度計(jì)。

注意：接觸試劑及供試品的所有器皿必須是無熱原的(我公司提供無熱原耗材)。

玻璃器皿可經(jīng) 250℃干烤至少 60 分鐘去除熱原。 2.  供試品的貯存與預(yù)處理

備注：   若供試品為血液類，請(qǐng)參照我廠配套血液相關(guān)處理試劑使用說明書。
2.1 供試品的 pH 值應(yīng)在 6 - 8 之間，若超出此范圍，需用無熱原緩沖液、0.1N 氫氧化鈉 或 0.1N 鹽酸調(diào)節(jié)。

2.2  若供試品中可能存在鱟實(shí)驗(yàn)的干擾物質(zhì)，處理參見【供試品的干擾試驗(yàn)】。

2.3 若供試品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖會(huì)產(chǎn)生 G 因子旁路反應(yīng)，干擾內(nèi)毒素 檢測(cè)），需選用特異性鱟試劑（我公司提供）。

2.4   若供試品為一些抗菌素如頭孢類抗菌素和磺胺制劑會(huì)對(duì)偶氮染色劑產(chǎn)生偶聯(lián)反應(yīng) 而干擾偶氮化顯色，需要選用不含偶氮化試劑的試劑盒（我公司提供）。

2.5 若供試品的本底吸光度值大于 0.5,必須對(duì)供試品進(jìn)行稀釋后再檢測(cè)。

2.6   若供試品顏色較深(例如溶血)，或在酸性條件下顏色加深(例如一些組織培養(yǎng)介質(zhì)), 必須設(shè)置供試品空白管以扣除供試品自身的顏色本底。 供試品空白管不加入鱟試劑，以等體積鱟試劑的溶劑(該處為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水) 代替。其余操作同供試品管。

3.實(shí)驗(yàn)操作

3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線所采用的內(nèi)毒素濃度可以為 0.01, 0.025, 0.05, 0.1 EU/ml 或 0.1, 0.25, 0.5,1.0

EU/ml。稀釋方法如下（以 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 EU/ml 為例）：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作品 1 支，按細(xì)菌內(nèi)毒素工作品使用說明書稀釋為 10EU/ml 的內(nèi)毒素溶液，再稀釋為 1.0EU/ml 的內(nèi)毒素溶液，以 1.0EU/ml 的內(nèi)毒素溶液為母液按下表稀釋成 0.1,0.25,

0.5, 1.0 EU/ml 的濃度梯度。配制好的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)在 4 小時(shí)內(nèi)用完。

3.2 陰性對(duì)照為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

鱟試劑：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑*溶解, 注意不要用旋渦混勻儀激烈振搖。溶解的鱟試劑應(yīng)在 10 分鐘內(nèi)用完。 顯色基質(zhì)：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于顯色基質(zhì)中，輕輕振搖使顯色基質(zhì) *溶解。顯色基質(zhì)溶液可在無污染的條件下于 4  ºC 貯存 8 小時(shí)以內(nèi)。 偶氮化試劑 1：按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑鹽酸于偶氮化試劑 1 中，

偶氮化試劑 2：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑 2 中， 偶氮化試劑 3：按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水于偶氮化試劑 3 中， 偶氮化試劑溶液可于 4ºC 貯存 1 周。

3.4 實(shí)驗(yàn)操作取無熱原試管，加入 100μl 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，或供試品。

再加入 100μl 鱟試劑溶液，混勻，37ºC 溫育 T1 分鐘。 溫育結(jié)束，加入 100μl 顯色基質(zhì)溶液，混勻，37ºC 溫育 T2 分鐘。 溫育結(jié)束，加入 500μl 偶氮化試劑 1 溶液，混勻，加入 500μl 偶氮化試劑 2 溶液，混勻加入 500μl 偶氮化試劑 3 溶液，混勻，靜置 5 分鐘，于 545nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度 值。(見表２)

【供試品的干擾試驗(yàn)】

供試品的干擾試驗(yàn)詳見《中華人民共和國(guó)藥典》2005  版中《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》的 “光度測(cè)定法干擾試驗(yàn)”。當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生物試劑工藝改變或試驗(yàn) 環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須進(jìn)行干擾試驗(yàn),步驟如下:

1  選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度（設(shè)為 λm），作為供試品干擾 試驗(yàn)中添加的內(nèi)毒素濃度，配制含 λm 內(nèi)毒素的供試品陽性對(duì)照，測(cè)量出該溶液 的內(nèi)毒素濃度,稱為 Cs；

2  測(cè)量出未添加外源內(nèi)毒素的供試品溶液內(nèi)毒素濃度,稱為 Ct；

3  計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率 R＝（Cs–Ct）/λm×100%

4  當(dāng) R 在 50%～200%之間，則認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。

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